两种原核表达载体对CsPPO蛋白表达活性的影响

doi:10.13305/j.cnki.jts.2018.04.007

茶叶科学 ›› 2018, Vol. 38 ›› Issue (4): 396-405.doi: 10.13305/j.cnki.jts.2018.04.007

两种原核表达载体对CsPPO蛋白表达活性的影响

甘玉迪, 孙康, 李会娟, 堵忠颖, 赵真, 庞鑫, 黎星辉, 陈暄^*

南京农业大学园艺学院,江苏南京210095

收稿日期:2018-04-04 修回日期:2018-04-26 出版日期:2018-08-15 发布日期:2019-10-15
通讯作者: *chenxuan@njau.edu.cn
作者简介:甘玉迪,女,硕士研究生,主要从事茶树遗传育种和茶叶生化研究。
基金资助:
国家现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-19）、国家自然科学基金（31470690）、江苏省现代农业产业技术体系（sxgc2017223）、南京农业大学SRT项目（1614C12）

Effect of Two Prokaryotic Expressed Vectors on the Activity of PPO from Camellia sinensis

GAN Yudi, SUN Kang, LI Huijuan, DU Zhongying, ZHAO Zhen, PANG Xing, LI Xinghui, CHEN Xuan^*

College of Horticulture, Nangjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

Received:2018-04-04 Revised:2018-04-26 Online:2018-08-15 Published:2019-10-15

摘要/Abstract

摘要： 为了选择合适载体,获得稳定表达且具有高活性的可溶性茶树多酚氧化酶,本研究以茶树叶片为材料,克隆茶树多酚氧化酶基因（CsPPO）,切除含43个氨基酸和70个氨基酸的肽段后分别与pET32a载体、pMAL-c5X载体进行重组构建原核表达载体,分别命名为pET32a-CsPPO₄₃、pET32a-CsPPO₇₀、pMALc5X-Cs PPO₄₃、pMALc5X-CsPPO₇₀,利用E. coil Transetta（DE3）菌株进行表达,经SDS-PAGE电泳检验,pMAL-c5X载体表达的目的蛋白易于提取,大量出现在上清液中;而pET32a载体表达后蛋白则基本存在于沉淀中。利用邻苯二酚、ECG、EC 3种底物在410βnm处检测CsPPO蛋白活性发现,pMALc5X-CsPPO对不同底物反应时酶活性随时间增加均呈现明显“S”型变化,表明茶树PPO氧化儿茶素类的反应并不是匀速过程。pMALc5X-CsPPO₄₃比活力比pMALc5X-CsPPO₇₀的高,其中pMALc5X-CsPPO₄₃与EC反应时酶比活力最高,最大比活力为1.45×10⁶β U·mg^-1。因此,可利用pMALc5X-CsPPO₄₃合成工业用PPO,为进一步研究其与儿茶素的反应机理,利用体外酶法高效获得茶黄素奠定基础。

关键词: 茶树, 多酚氧化酶, 原核表达, 酶活性

Abstract: To get stably soluble tea polyphenol oxidase with high activity, two vectors were selected to express CsPPO. A tea polyphenol oxidase gene was cloned from tea leaves. After trimming two peptide fragments with 43 and 70 amino acids, the sequences were connected into pET32a and pMAL-c5X vectors with BamH I/xho I and Sal I/ BamH I and named as pET32a-CsPPO₄₃, pET32a-CsPPO₇₀, pMALc5X-CsPPO₄₃ and pMALc5X-CsPPO₇₀ respectively. After expressed of recombinant plasmids in the E.coil Transetta (DE3) strain, SDS-PAGE results showed that the protein expressed by pMAL-c5X was easier extracted than that by pET32a. The proteins expressed by pMAL-c5X were found in both the supernatant and pellet, while those by pET32a were only found in the pellet. The activity of CsPPO was detected by 1,2-benzenediol, ECG and EC as substrates in 410 nm with micro-plate reader. The ‘S’ shaped curves graphed with three substrates oxidized by the pMALc5X-CsPPO indicated that all reaction speeds were not constant. The specific activity of pMALc5X-CsPPO₄₃ was higher than that of pMALc5X-CsPPO₇₀, with the highest activity reaching 1.45×10⁶βU·mg^-1 when reacted to EC. Therefore, pMALc5X-CsPPO₄₃ could be used to synthesize industrial PPO, but its role in catechin mechanism still needs further research.

Key words: Camellia sinensis, polyphenol oxidase, Prokaryotic expression, enzymatic activity

中图分类号:

TS272.2
Q52

甘玉迪, 孙康, 李会娟, 堵忠颖, 赵真, 庞鑫, 黎星辉, 陈暄. 两种原核表达载体对CsPPO蛋白表达活性的影响[J]. 茶叶科学, 2018, 38(4): 396-405. doi: 10.13305/j.cnki.jts.2018.04.007.

GAN Yudi, SUN Kang, LI Huijuan, DU Zhongying, ZHAO Zhen, PANG Xing, LI Xinghui, CHEN Xuan. Effect of Two Prokaryotic Expressed Vectors on the Activity of PPO from Camellia sinensis[J]. Journal of Tea Science, 2018, 38(4): 396-405. doi: 10.13305/j.cnki.jts.2018.04.007.

参考文献 20

[1]	王曼玲, 胡中立, 周明全,等.植物多酚氧化酶的研究进展[J]. 植物学通报, 2005(2): 215-222.
[2]	宛晓春. 茶叶生物化学[M]. 北京:中国农业出版社, 2003.
[3]	刘仲华, 施兆鹏. 红茶制造中多献氧化酶同工酶谱与活性的变化[J]. 茶叶科学, 1989, 9(2): 141-150.
[4]	王坤波, 刘仲华, 赵淑娟, 等. 多醋氧化酶同工酶组成对茶黄素合成的影响[J]. 农业现代化研究, 2007, 28(5): 618-621.
[5]	谭淑宜, 朱尚同, 龚范武. 利用同工酶技术对江华苦茶等五个茶树品种亲缘关系的研究初报[J]. 湖南农学院学报. 1983(3): 63-69.
[6]	李桂琴. 鸭梨多酚氧化酶基因CDS区的克隆及表达[J]. 果树学报, 2008, 25(4): 577-580.
[7]	Newman S M, Eannetta N T, Yu H, et al.Organisation of the tomato polyphenol oxidase gene family[J]. Plant Molecular Biology, 1993, 21(6): 1035-1051.
[8]	Thygesen P W, Dry I B.Robinson. Polyphenol oxidase in potato[J]. Am Soc Plant Biol, 1995, 109(5): 525-531.
[9]	赵东, 刘祖生, 奚彪. 茶树多酚氧化酶基因的克隆及其序列比较[J]. 茶叶科学, 2001, 21(2): 94-98.
[10]	陈忠正, 李斌, 黎秋华, 等. 茶叶多酚氧化酶的基因克隆与序列分析[J]. 食品工业科技, 2006 (10): 109-111.
[11]	刘敬卫, 黄友谊, 丁建, 等. 茶树多酚氧化酶成熟蛋白的原核表达[J]. 茶叶科学, 2010, 30(2): 136-140.
[12]	吴贻良. 茶叶多酚氧化酶基因的克隆及微生物表达[D]. 广州: 华南师范大学, 2009.
[13]	王乃栋, 张丽霞, 黄晓琴, 等. 茶树PPO融合蛋白真核表达载体的构建与表达[J]. 茶叶科学, 2012, 32(3): 269-275.
[14]	陈娇, 孙长君, 杨昭, 等. 香蕉多酚氧化酶成熟蛋白的原核表达[J]. 热带作物学报, 2015, 36(12): 2198-2203.
[15]	刘敬卫. 茶树多酚氧化酶的基因克隆与原核表达[D]. 武汉: 华中农业大学, 2009.
[16]	陈炜烨, 刘冬冬, 徐建华, 等. ImageJ软件在重组质粒pET32a-CDK2中蛋白表达的应用[J]. 中国热带医学, 2014, 14(1): 23-25.
[17]	黄意欢. 茶学实验技术[M]. 北京: 中国农业出版社, 1997.
[18]	陈东生, 王坤波, 黄建安, 等. 茶树多酚氧化酶研究进展[J]. 茶叶通讯, 2012, 39(2): 17-21.
[19]	韩杰, 郑继平, 言普, 等. 原核表达番木瓜环斑病毒NIa-Pro及其双重酶活鉴定[J]. 热带作物学报, 2016, 37(4): 722-727.
[20]	Agarwal S, Jha S, Sanyal I.Expression and purification of recombinant human alpha1-proteinase inhibitor and its single amino acid substituted variants in Escherichia coli for enhanced stability and biological activity[J]. J Biotechnol, 2010, 147(1): 64-72.

两种原核表达载体对CsPPO蛋白表达活性的影响

Effect of Two Prokaryotic Expressed Vectors on the Activity of PPO from Camellia sinensis

PDF (PC)

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

参考文献 20

相关文章 15

Metrics

本文评价

推荐阅读 10

[1]	王留彬, 黄丽蕴, 滕翠琴, 吴立赟, 成浩, 于翠平, 王丽鸳. 梧州茶树种质资源的遗传多样性及亲缘关系分析[J]. 茶叶科学, 2022, 42(5): 601-609.
[2]	周汉琛, 杨霁虹, 徐玉婕, 吴琼, 雷攀登. 香叶醇生物合成相关基因NUDX1的进化分析[J]. 茶叶科学, 2022, 42(5): 638-648.
[3]	陈琪予, 马建强, 陈杰丹, 陈亮. 利用图像特征分析茶树成熟叶表型的遗传多样性[J]. 茶叶科学, 2022, 42(5): 649-660.
[4]	孙悦, 吴俊, 韦朝领, 刘梦月, 高晨曦, 张灵枝, 曹士先, 余顺甜, 金珊, 孙威江. 抗小贯松村叶蝉和茶棍蓟马的茶树种质筛选及其抗性相关因素分析[J]. 茶叶科学, 2022, 42(5): 689-704.
[5]	王玉源, 刘任坚, 刘少群, 舒灿伟, 孙彬妹, 郑鹏. 茶树R2R3-MYB转录因子CsTT2表达分析及功能初步鉴定[J]. 茶叶科学, 2022, 42(4): 463-476.
[6]	刘建军, 张金玉, 彭叶, 刘晓博, 杨云, 黄涛, 温贝贝, 李美凤. 不同光质摊青对夏秋茶树鲜叶挥发性物质及其绿茶品质影响研究[J]. 茶叶科学, 2022, 42(4): 500-514.
[7]	邢安琪, 武子辰, 徐晓寒, 孙怡, 王艮梅, 王玉花. 茶树富集氟的特点及其机制的研究进展[J]. 茶叶科学, 2022, 42(3): 301-315.
[8]	王涛, 王艺清, 漆思雨, 周喆, 陈志丹, 孙威江. 茶树CLH基因家族的鉴定与转录调控研究及其在白化茶树中的表达分析[J]. 茶叶科学, 2022, 42(3): 331-346.
[9]	刘任坚, 王玉源, 刘少群, 舒灿伟, 孙彬妹, 郑鹏. 茶树CsbHLH024和CsbHLH133转录因子功能鉴定[J]. 茶叶科学, 2022, 42(3): 347-357.
[10]	欧阳珂, 张成, 廖雪利, 坤吉瑞, 童华荣. 基于感官组学分析玉米香型南川大茶树工夫红茶特征香气[J]. 茶叶科学, 2022, 42(3): 397-408.
[11]	刘富浩, 范延艮, 王域, 孟凡月, 张丽霞. 茶树黄金芽CsHIPP26.1蛋白螯合离子的筛选与鉴定[J]. 茶叶科学, 2022, 42(2): 179-186.
[12]	杨妮, 李逸民, 李静文, 滕瑞敏, 陈益, 王雅慧, 庄静. 外源5-ALA对干旱胁迫下茶树叶绿素合成和荧光特性及关键酶基因表达的影响[J]. 茶叶科学, 2022, 42(2): 187-199.
[13]	疏再发, 郑生宏, 邵静娜, 周慧娟, 吉庆勇, 刘瑜, 何卫中, 王丽鸳. 不同茶树品种（系）对减半施肥的响应研究[J]. 茶叶科学, 2022, 42(2): 277-289.
[14]	陈潇敏, 赵峰, 王淑燕, 邵淑贤, 吴文晞, 林钦, 王鹏杰, 叶乃兴. 福建野生茶树资源嘌呤生物碱构成评价及特异资源筛选[J]. 茶叶科学, 2022, 42(1): 18-28.
[15]	刘庆帅, 璩馥榕, 魏梦园, 钟红, 王熠, 陈亮, 金基强. 基于UPLC技术解析金萱×紫娟F₁分离群体代谢物的遗传变异[J]. 茶叶科学, 2022, 42(1): 29-40.